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蛋白组学差异表达分析


Label free差异分析

蛋白质非标记定量技术(label-free)是通过液质联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析,无需使用昂贵的稳定同位素标签做内部标准,只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据,比较不同样品中相应肽段的信号强度,从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。

非标记定量蛋白质组学已成为越来越重要的质谱定量方法,按照其原理主要分为两种:

[1]  Spectrum counts类的非标记定量方法:发展比较早,已经形成多种定量算法,但主要原理都是以MS2的鉴定结果为定量基础,各种方法的差别在于后期算法在大规模数据上的修正。

[2]  另一种非标记定量方法的原理是以MS1为基础,计算每个肽段的信号强度在LC-MS色谱上的积分,MaxQuant是领先的蛋白质组学定性定量算法,现在已经渐渐成为蛋白质组学领域内的标准解决方案之一。

 

SILAC差异分析

细胞培养氨基酸稳定同位素标记(Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture, SILAC),这种方法首先是由2002年丹麦Mann实验室的Ong等对AACT技术作了进一步改进而获得,并首次应用于定量蛋白质组学研究,为全面、系统地定性和定量分析复杂哺乳动物细胞蛋白质组提供了有效的解决方案。

分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸,细胞经5-6代倍增周期后,稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白质按细胞数或蛋白量等比例混合,经分离、纯化后进行质谱鉴定。

 

iTRAQ/TMT差异分析

 iTRAQ(Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation)TMT(Tandem Mass Tags)技术是分别由美国AB Sciex公司和Thermo公司研发的多肽体外标记定量技术。这两种技术采用2-10种稳定同位素标签,通过特异性标记多肽的氨基基团,然后进行串联质谱分析,可同时比较多达10种不同样本中蛋白质的相对含量。

 iTRAQ/TMT试剂由三部分组成:报告基团、平衡基团和反应基团。反应基团形成2-10种等质量同位素标签。iTRAQ/TMT试剂标记酶解后的肽段,可与氨基酸N端及侧链的伯胺基团发生反应。在一级谱图中,来自于不同样本的同一肽段,标记后表现为相同的质荷比。在二级谱图中,报告基团、平衡基团和反应基团之间的键断裂,带不同同位素标签的同一肽段产生质量不同的报告离子,根据报告离子的丰度可获得样本间相同肽段的定量信息,再经过软件处理得到蛋白质的定量信息。其基本原理与技术流程如下图所示: